Структура m-PHK в проблеме расшифровки строения нуклеиновых кислот представляла собой частный случай. Самой важной и принципиальной была расшифровка последовательностей ДНК — молекул, из которых построены гены. Собственно, на основании строения m-PHK можно было сделать заключение и о строении одного гена, а именно гена, на котором синтезируется m-PHK. Это позволило перейти к попыткам синтеза генов. Но об этом будет рассказано далее, а здесь необходимо остановиться на работах по расшифровке строения индивидуальных ДНК. Перспективы этого некоторым ученым казались невероятными. Еще в 1968" г. Э. Чаргафф писал,
что детальное определение последовательностей нуклеотидов в молекуле ДНК находится вне возможностей современной науки. Он утверждал что прочитать полную нуклеотидную последовательность ДНК удастся лишь в XXI в. Однако уже в середине 70-х годов задача была в основном решена. При этом принцип расшифровки предложенный в лабораториях Ф.Сенгера (Англия) и У.Гилберта (США), оказался даже более простым и доступным, чем метод расшифровки строения белков.
Исключительную роль в этом сыграли работы Ф. Сенгера, который в 60-х годах с расшифровки строения белков переключился на расшифровку строения нуклеиновых кислот. Он предложил в 1965 г. метить нуклеиновые кислоты изотопами 32Р, что позволило работать с чрезвычайно малыми массами анализируемого материала (менее 10~6 г). Затем им был разработан ряд методов определения положения нуклеотидов в цепи нуклеиновой кислоты. Определение идет с помощью синтеза комплементарных ДНК на однонитчатой ДНК как на матрице. Именно эта матрица и является тем поли нуклеотидом, последовательность которого необходимо установить. По методу Сенгера в четырех параллельных пробах синтезируются все возможные фрагменты поли нуклеотида с остановкой реакции на заданном основании (А, Т, Г или Ц в четырех параллельных пробах). Затем с помощью электрофореза на полиакриламидном геле получают «карту» всех таких фрагментов, длина которых дает точное положение определяемого основания вдоль цепи.
С помощью метода расшифровки в 1967 г. была выявлена первичная структура 5S РНК (120 оснований). В 1976 г. В. Фирс с сотрудниками (Бельгия) установил полную химическую структуру первого живого организма — бактериофага MS2, для которого стала таким образом известна химическая формула. Этот бактериофаг представлял собой нить РНК из 3569 нуклеотидов. Кроме того, в- состав его входили 180 одинаковых белковых молекул и так называемый А-белок — всего одна молекула, которая определяла форму оболочки организма.
В 1977 г. Ф. Сенгер выяснил структуру фага, состоящего из ДНК (Ф XI74) и включающего 5375 оснований. Затем он перешел к расшифровке генов — генома митохондрий человека и быка, включающих приблизительно 16 500 оснований. В начале 70-х годов У. Гилбертом и М. Максэмом (США) был разработан и другой метод определения последовательности нуклеотидов. В нем использовали тот же принцип — определение положения оснований вдоль цепи ДНК. Однако вместо синтеза исследуемую нить просто расщепляли по одному из оснований, предварительно пометив конец нити радиоактивным фосфором згр. в разработке этого метода принимали участие советские ученые. В 1973 г. Е.Д.Свердлов с сотрудниками предложил идею совместного определения аденина и гуанина. В 1976 г. она была осуществлена совместно У. Гилбертом, М. Максэмом и А. Д. Мирзабековым. За эти работы Ф. Сенгер и У. Гилберт были отмечены Нобелевской премией.
|