Для синтеза первого гена X. Г. Коране необходимо было соединить 77 нуклеотидов, комплементарных тем нуклеотидам, которые входят в состав аланиновой m-PHK. До этого X. Г. Корана мог соединять только 10—12 нуклеотидов, порядок которых можно было контролировать. Дальше химическим путем наращивать цепочки становилось все труднее. Лишь ценой значительных усилий удалось получить фрагмент гена в 20 нуклеотидных остатков. Но в 1967 г. был открыт фермент ДНК-лигаза, восстанавливающий дефектную нить в поврежденной двойной спирали, соединяя разорванные связи. Для последующих этапов синтеза X. Г. Корана и использовал свойства этого фермента. Он действовал по следующей схеме: если на одну из цепей ДНК наложить два комплементарных куска большей суммарной длины, то образуется двойная спираль, у которой одна нить будет целая, а другая разорванная посередине. При этом свободные концы такой цепи будут висеть в растворе. ДНК-лигаза сошьет место разрыва, после чего свободные концы можно использовать для повторения подобной операции. При этом синтезируется сразу двойная спираль гена. Таким путем был синтезирован ген аланиновой m-PHK. Сообщение об этом X. Г. Корана сделал на VII Международном симпозиуме по химии природных соединений, который состоялся в СССР в 1970 г. Его работа стала как бы символом начавшегося прогресса биоорганической химии и молекулярной биологии.
В дальнейшем были синтезированы многочисленные гены. В Советском Союзе в Институте биоорганической химии М.М.Шемякина были синтезированы два структурных гена, кодирующие последовательность очень важных биологически активных пептидов — лейцинэнкефалина и брадикинина.
Была синтезирована также промотррная часть ДНК бактериофага fd, ответственного за узнавание одного из ключевых ферментов клетки —РНК-по лимеразы и регуляцию активности генов.
Но ученых манила еще более смелая задача: не просто синтезировать ген, но заставить работать его внутри клетки. Оказалось, что с помощью некоторых вирусов можно добиться внедрения в гены ряда клеток (бактериальных или в чистых культурах) чужеродных генов. В начале 70-х годов были выполнены многочисленные работы по модификации генетического аппарата различных организмов — бактерий, растений, животных, насекомых. Стало возможным получать гибридные наследственные молекулы, вводить гены одних организмов в клетки других.
При введении синтетических генов в живые организмы обнаружилось, что полный ген, способный проявлять активность, должен состоять не только из той части, на которой записана информация о последовательности аминокислотных остатков синтезируемого белка, но и содержать другие фрагменты в начале и конце полинуклеотидной цепи. Эти фрагменты надо было не только синтезировать, но сначала изучить. Кроме того, необходимо было подобрать системы внедрения таких генов в клетку. Однако все трудности удалось преодолеть, Сейчас выполнены многочисленные работы, начатые X. Г. Кораной, который ввел синтезированный им ген и - РНК в клетку. Это произошло в 1976 г. Последовательность проделанной работы была такова: сначала был синтезирован сам ген, но он оказался биологически неактивным. Выяснили, что в клетке нормально синтезируется не обычная и - РНК, а РНК - предшественница, а она состоит из 126 нуклеотидов. Специальный фермент отрезает от предшественницы лишнюю часть, превращая ее в активную и - РНК. Далее был синтезирован ген предшественницы. Но и он не работал. Тогда определили последовательности регуляторных участков гена— промотора и терминатора, первый из которых содержал 59 пар нуклеотидов, а второй —21 нуклеотид. После этого был, наконец, синтезирован полный ген и - РНК.
|