Ф. Сенгер разработал метод определения N-концевых групп аминокислотных остатков, т. е. тех аминокислотных остатков полипептидной цепи, которые содержат свободную аминогруппу. Для этого он метил концевую аминокислоту, обрабатывая белок динитрофторбензолом;
Из полученного затем гидролизата ДНФ-аминокислоту выделяли тем или иным способом, а затем определяли, какая именно аминокислота входила в это соединение. Таким образом можно было определить N-концевую аминокислоту любого белка. Кроме того, можно было узнать, сколько различных полипептидных цепей входит в его молекулу. За эти исследования Ф. Сенгеру была присуждена Нобелевская премия. Были разработаны и другие методы определения N-концевых остатков аминокислот.
Аналогичные методы были созданы и для определения С-концевых аминокислот, т. е. обладающих свободной карбоксильной группой. Среди них большое распространение имел метод, при котором белок изучали с помощью другого белка— фермента карбоксипептидазы. Карбоксипептидаза способна отщеплять от полипептидной цепи только С-концевую аминокислоту, не нарушая других пептидных связей. Так, если после обработки белка карбоксипептидазой обнаруживают в растворе свободную аминокислоту, например аланин, то можно считать доказанным, что С-концевой аминокислотой в исследуемом белке является аланин.
В результате разработки этих методов темпы исследований белков резко возросли. Это было связано с рядом причин. Были усовершенствованы методы выделения некоторых чистых препаратов — белков-гормонов, белков-ферментов, белковых компонентов вирусов. Изучение их структуры было очень важно, так как обещало прорыв в ранее недоступные области изучения биологических функций белка. Это был путь к молекулярной биологии и биоорганической химии.
Появились не только новые, более простые и надежные методы исследований белков, но начался процесс автоматизации экспериментальной работы. Сначала были созданы автоматические анализаторы аминокислот, позволившие за считанные минуты проводить количественные определения содержания аминокислот в любом белке или пептиде. Г. Эдман сконструировал полуавтоматический прибор секвенатор, выявлявший последовательность аминокислот в полипептидной цепи по фенилозотиоцианатному методу. Сейчас разработано множество различных моделей таких приборов.
В 50-х годах в течение нескольких лет Ф. Сенгер работал над расшифровкой строения белка инсулина. Его работа увенчалась успехом: была установлена формула первого индивидуального белка. При этом блестяще подтвердилась пептидная теория Э.Фишера: инсулин был полипептидом и, кроме полипептидных цепей, не содержал никаких иных, особых химических группировок. Число белков, для которых была выяснена полная формула, стало быстро увеличиваться. Вслед за инсулином установили формулу первого фермента— рибонуклеазы — белка, содержащего одну полипептидную цепь из 124 аминокислотных остатков. Это была очень важная работа, так как было показано, как с помощью дисульфидных мостиков остатков аминокислоты цистеина полипептидная цепь складывается в сложную структуру, какие аминокислотные остатки (вернее их боковые цепи), сближаясь, образуют активный центр фермента.
|